狂犬病病原學和實驗室診斷

病原學

狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)屬于單負病毒目(Mononegavirales)彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)??袢〔《绢w粒呈子彈狀,長100-300nm,直徑約75nm。病毒基因組長約12kb,為不分節段的單股負鏈RNA,從3’到5’端依次編碼5種結構蛋白,分別為核蛋白(Nucleoprotein, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質蛋白(Matrixprotein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)和依賴RNA的RNA多聚酶(RNAdependent RNA polymerase or Large protein,L)。病毒顆粒由囊膜(Envelope)和核衣殼(Nucleocapsid)兩部分組成,基因組RNA及外層緊密盤繞的N、P、L蛋白共同構成具有轉錄、翻譯功能的核衣殼;顆粒外層脂質膜表面鑲嵌著G蛋白以三聚體構成的纖突(Spike),為病毒中和抗原及與宿主受體結合的部位,M蛋白位于外殼內側和核衣殼之間,連接內外兩部分。


狂犬病病毒不耐高溫,懸液中的病毒經56℃ 30-60分鐘或100℃ 2分鐘即失去感染力。腦組織內的狂犬病病毒在常溫、自溶條件下,可保持活力7-10天,4℃可保存2-3周??袢〔《驹趐H 7.2-8.0較為穩定,超過pH 8易被滅活??袢〔《緦χ軇ǚ试硭?、氯仿、丙酮等)、乙醇、過氧化氫、高錳酸鉀、碘制劑以及季銨類化合物(如苯扎溴銨)等敏感。1:500稀釋的季胺類消毒劑、45%-70%乙醇、1%肥皂水以及5%-7%碘溶液均可在1分鐘內滅活病毒,但不易被來蘇水溶液滅活。


不同型別狂犬病病毒的致病性不同:在犬、貓等哺乳動物中傳播,也稱“街毒”的狂犬病病毒毒力很強,感染后一旦出現臨床癥狀,病死率幾乎100%,是世界上病死率最高的傳染??;而在蝙蝠中傳播的狂犬病病毒毒力相對較弱。


直到20世紀50年代,RABV一直被認為是狂犬病的唯一病原。通過對來自尼日利亞的與RABV有血清學相關性的病毒即LBV(Lagosbat virus)和MOKV(Mokola virus)的鑒定,以及對1970年分離自南非被蝙蝠咬傷病人的DUVV(Duvenhage virus)病毒的分析,發現了狂犬病病毒群的復雜性,由此出現了“狂犬病相關病毒(Rabies-related virus)”和“狂犬病血清型”的術語,目前分別將RABV、LBV、MOKV、DUVV確定為四種血清型。


1950年以來在歐洲分離到的蝙蝠病毒與DUVV呈血清學相關性,應用單克隆抗體反應將歐洲蝙蝠病毒進一步分為EBLV-1(European bat lyssavirus 1)和EBLV-2(European bat lyssavirus 2)。針對狂犬病相關病毒多樣性的遺傳進化研究,產生了新的專業術語“基因型”,并繼續發現了新的基因型,如1997年從澳大利亞果蝠中分離到的ABLV(Australian bat lyssavirus)確定為基因7型。為了更好地對日益增多的狂犬病相關病毒進行歸類,國際病毒分類委員會(International Committee of Taxonomy Virus, ICTV)主持設立了狂犬病病毒屬,將現存的基因型作為狂犬病病毒分類的基礎,并結合系統發生進化樹的拓撲結構、單克隆抗體反應譜,以及生態、宿主、地理范圍等特征確立了病毒種類。


2014年,ICTV最新分類結果明確了14種(Species)狂犬病病毒。除了上述7個基因型代表7種不同的狂犬病病毒外,21世紀新發現的另外7種病毒包括從中亞食蟲蝙蝠中分離到的KHUV(Khujand virus)和ARAV(Aravanvirus),從俄羅斯食蟲蝙蝠中分離到的IRKV(Irkutvirus)和WCBV(West Caucasian batvirus),從非洲肯尼亞食蟲蝙蝠中分離到的SHIBV(Shimonibat virus),從法國、德國食蟲蝙蝠中分離到的BBLV(Bokelohbat lyssavirus)和坦桑尼亞非洲靈貓身上分離到的IKOV(Ikoma lyssavirus)。2011年從西班牙蝙蝠中分離到的LLEBV(Lleida bat lyssavirus)尚未經ICTV明確歸類。


實驗室診斷

標本采集:病人發病后(死亡前)可采集其唾液(間隔3-6小時,至少采集3份)、腦脊液、血清及頸后帶毛囊的小塊皮膚;病人死后最好采集其腦組織標本(小腦和腦干)進行實驗室檢測。


直接免疫熒光法(DirectFluorescent Antibody Test, DFA)是狂犬病診斷的金標準,可以快速、敏感、特異地檢測人和動物腦組織中的病毒抗原。臨床病例活體組織標本(如頸后部皮膚毛囊)亦可進行DFA檢測。直接快速免疫組化法(Direct RapidImmunohistochemical Test, DRIT)及酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-linkedImmuno Sorbent Assay, ELISA)亦可特異檢測狂犬病病毒抗原。


病毒核酸檢測可用于早期診斷,以逆轉錄PCR法(Reverse Transcription-PCR, RT-PCR)(包括Real-timeRT-PCR)檢測體液(唾液、血清等)和腦組織等標本,但需要嚴格的質量控制以保證結果的準確性。腦組織及唾液等病毒含量高的樣本還可進行病毒分離。細胞培養分離所需時間(1-2天)遠少于小鼠顱內接種分離法所需時間(10-21天),且前者的生物安全風險遠小于后者。


未接種過疫苗的患者,發病早期幾乎沒有中和抗體產生,到發病晚期(通常在臨床癥狀出現后7-8天),病毒在腦內大量增殖后突破血腦屏障進入血液,刺激機體產生低水平的中和抗體。通過病毒中和試驗檢測病人血清或腦脊液中的中和抗體,可作為狂犬病診斷的依據之一。


世界衛生組織(World HealthOrganization, WHO)推薦的抗狂犬病病毒中和抗體標準檢測方法包括快速熒光灶抑制試驗(RapidFluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)和小鼠腦內中和試驗(Mouse Neutralization Test,MNT)。由于RFFIT法無需使用小鼠,所用時間短(24小時),目前已被廣泛采用。RFFIT方法也是我國現行藥典規定的檢測狂犬病病毒中和抗體的標準方法之一。此外,常用的狂犬病病毒中和抗體檢測方法還有熒光抗體病毒中和試驗(Fluorescent AntibodyVirus Neutralization Test, FAVNT)。用ELISA法測定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗體滴度與用病毒中和試驗測定的結果有一定的相關性(約80%符合率),但相應試劑盒尚未普及。


此外,還可以通過檢測中和抗體,監測暴露前抗體背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。WHO狂犬病專家咨詢委員會認為:中和抗體水平等于或高于0.5IU/ml時,接種者才具備了有效的保護能力;如果發現中和抗體水平低于0.5IU/ml,應進行加強免疫,至達到有效保護水平為止。


 

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